接下来Shi团队针对装载CAR编码质粒的去核MSC递送系统的靶向精准性和安全性进行了验证。实验采取细胞松弛素B处理小鼠脂肪源性间充质基质细胞（MSCs），通过Ficoll梯度超速离心获得eMSC。形态学观察显示获得的eMSC可贴壁生长；肌动蛋白红色荧光标记（Actin-Tracker Red-555）显示完整细胞骨架；DAPI核染色证实胞浆内无细胞核残留；透射电镜（TEM）进一步验证了去核成功。值得注意的是，eMSC体积显著小于完整细胞（，但保留了高尔基体、内质网、线粒体、溶酶体和内体等关键细胞器，且维持与亲代MSCs相近的Zeta电位。WB实验验证eMSC仍保留CD105和CXCR4的表达；此外，eMSCs表面P-选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）在去核后24小时内保持稳定表达并能与P/E-选择素特异性结合，说明其表面PSGL-1具有功能活性。以上结果表面eMSC保留关键细胞结构的同时还具有定向趋化迁移能力和内皮细胞粘附功能，这些特性为其精准递送奠定了基础。

下一步，作者探究了静脉注射的eMSC是否能在体内定向归巢至胶质瘤组织。通过DiD标记eMSC，利用活体光谱成像系统（IVIS）追踪其在胶质瘤模型小鼠体内的分布动态，发现eMSC在脑部高效富集，脑内荧光信号持续增强，48小时达到峰值。与MSC细胞相比，eMSC在所有时间点均表现出更强的归巢能力；72小时脑组织切片显示，eMSC实现了胶质瘤内精准定位，与MSC相比，eMSC呈更小的点状分布，且与GAM共定位；其流式的荧光信号时MSC细胞的4倍；其中65%以上被GAM摄取，非免疫细胞摄取率仅10.56±2.03%。

通过CCK-8检测发现，eMSC去核后存活时间约60小时，eMSC最终通过凋亡途径死亡，凋亡相关蛋白Caspase-3/Bax上调、Bcl-2下调。

这些发现共同证明：eMSC通过自发归巢至胶质瘤部位后，由核缺失触发的凋亡过程可实现GAM的精准靶向，为后续质粒递送奠定基础。

递送效率比较

高效非病毒基因递送载体，（39）。本研究采用优化脂质配比制备的脂质纳米颗粒（LNP）作为LNP/pCAR作为对照，LNP因其体内高转染效率已成功应用于基因治疗临床。动态监测脑内信号发现，eMSC/pCAR组：12小时脑部信号显著，48小时持续增强，对照组12小时到达峰值后逐渐衰减，72小时与肿瘤信号共定位，eMSC/pCAR组荧光强度是对照组的3倍。

治疗方案与效果评估

在GL261原位胶质瘤模型中，联合递送pCAR与高活性piggyBac转座酶（iPB7），通过eMSC/pCAR在体内重编程瘤周GAM表达CD133靶向CAR。体内生物成像显示eMSC/pCAR组抗肿瘤效果最强，显著优于对照组；H&E与TUNEL染色显示eMSC/pCAR组肿瘤损伤和细胞凋亡最显著；CD133⁺肿瘤细胞平均荧光强度降低，靶点清除明显，Ki67染色提示体内增殖显著被抑制；生存获益方面，eMSC/pCAR组中位生存期延长至57天（PBS组36天）；治疗20天内小鼠体重稳定，而其他组迅速下降。

作者后续将eMSC/pCAR联合CD47阻断疗法，解除免疫抑制，协同增强吞噬效果，进一步提升了肿瘤治疗作用，在此不再阐述，有兴趣的伙伴可以查看原文了解更详细的内容。

该研究基于胶质瘤微环境中GAM的高占比特性采用in vivo原位生成CAR-M，创新性地利用去核MSC载体将CAR质粒定点递送到肿瘤浸润的巨噬细胞，保留趋化功能但消除转录风险，与传统的LNP相比原位CAR-M生成量提升5倍。eMSC/pCAR靶向CD133直接清除肿瘤细胞，CD47阻断解除免疫抑制，协同增强吞噬效果，为GBM的治疗提供了高效性与安全性的全新策略。该技术平台也为其它巨噬细胞相关疾病治疗提供了思路如：自身免疫性疾病（系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等）以及神经退行性疾病（多发性硬化症），其模块化设计支持快速更换靶向抗原适配不同适应症。