研究文章：保存条件对细胞外囊泡质量的影响
越来越多的证据表明，存储方式对细胞外囊泡（EV）的特性会产生影响。虽然-80℃保存是普遍采用的方法，但过往的研究表面-80℃长期保存仍然对EV的尺寸、样品浓度、蛋白聚集等特性产生明显的影响。今天小翊分享一篇研究性文章：The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study，该研究通过系统化的实验评估了-80℃存储和冻融循环对EVs的影响：测试了八种存储策略的差异，并探究了存储过程中可能发生的融合现象。研究发现，EV在-80℃的存储会以时间依赖性的方式发生变化，具体的是，其浓度、样品纯度降低，同时颗粒尺寸及尺寸变异性会增加，并改变EVs的zeta电位，导致尺寸-电荷分布图中的EVs发生位移。冻融循环会导致EV减少，并引起颗粒尺寸的循环依赖性增大。另外，存储过程中EV还发生了融合现象。这些结果提示采用新鲜的EV样本进行后续的研究或应用，或优化其保存过程非常必要。
1）EV浓度
作者评估了-80°C存储对新鲜分离的细胞外囊泡（FE）和血浆样本中EV得率及杂质蛋白浓度的影响。-80°C保存过程会逐渐降低FE样本中的EV浓度，且时间越久降低越显著。新鲜样本、保存4周及保存6个月的EV浓度中位值分别为4.36×10¹⁰、3.87×10¹⁰、2.99×10⁹。同时，-80°C存储也会降低血浆保存后的EV回收率，新鲜血浆样本、保存4周及保存6个月的EV浓度中位值分别为4.36×10¹⁰、1.83×10¹⁰、2.79×10⁹。
2）杂质蛋白浓度
在FE与部分纯化血浆（pPFP）样本中，杂质蛋白浓度均呈现随时间增长而上升的趋势，新鲜FE样本、保存4周及保存6个月的杂质蛋白浓度中位值分别为4.20 μg/mL、11.25 μg/mL、14.28 μg/mL；pPFP三个时间点的杂质蛋白浓度中位值分别为4.20 μg/mL、7.00 μg/mL、24.72 μg/mL。
3）EV尺寸
FE样本中的EV尺寸随存储时间延长而增大，三个时间点FE样本中位尺寸分别为84.77 nm、91.44 nm、107.40 nm。-80℃存储还增大了尺寸分布的离散度，表现为尺寸分布四分位距（IQR）随时间显著增加。然而，pPFP样本的中位尺寸和变异性在存储期间未发生显著变化。
4） EV浓度、尺寸和杂质蛋白浓度关联性
Kendall tau-b相关分析发现，EV颗粒浓度与尺寸呈负相关，而颗粒尺寸与污染物蛋白浓度呈正相关。在FE和pPFP样本中，Zeta电位中位值随时间均未出现显著变化。Zeta电位变异性也未发现显著差异。
可视化分析发现，FE样本存储后不同尺寸颗粒的Zeta电位电荷分布发生显著改变。经过6个月-80℃的保存，EV呈现更高Zeta电位值的趋势，颗粒群体向正电位方向偏移。而在血浆存储样本中，这种分布变化得到了明显抑制。
作者使用了不同的冻存体系重悬EV进行-80℃的保存，采用广义线性模型（双因素混合方差分析）来检测存储时间和存储条件对EVs样本特性的影响，同时评估其独立影响及交互作用（下图）。所有的存储体系均随着保存时间的延长导致EV浓度下降，其中6个月后浓度下降最显著。此外，模型未发现时间与存储条件之间存在显著交互作用。换言之，所有测试策略均无法通过与时间的交互作用来阻止其对EVs浓度的影响。杂质蛋白浓度、颗粒尺寸及Zeta电位也有类似的影响，保存液的成分改变并未缓解-80℃保存随着时间延长对EV质量的负面影响。
细胞存储前通常采用程序降温，以更好地保护细胞的活率。作者为了探索程序降温是否对EV的质量有保护效果，对比了快速冷冻与程序化慢速冷冻两种冻融循环方式对EV浓度、尺寸及杂质蛋白的影响。
冻融循环前后的透射电镜分析均证实：EV浓度随冻存循环过程显著降低（首次冻融后尤为明显），同时伴随颗粒尺寸的普遍增大。电镜成像未显示两种冻融方式存在差异。免疫金标记实验证实：与新鲜样本相比，冻融处理后CD63标记的EVs尺寸增大。杂质蛋白浓度在前两个冻融循环中则未随着冻融循环过程而增加。
作者随后还对EV膜结构的完整性进行了评估。将通过法尼基化修饰连接膜结构的荧光标记单色EVs（fGFP与fmCherry）混合，流式分析冻融后双阳性EVs的出现率，可指示膜结构破坏及脂质再胶束化现象。
作者首先建立了两种表达fGFP或fmCherry的单克隆工程细胞系，通过流式细胞术分析稳定转染和蛋白表达情况，并验证多次传代后平均荧光强度（MFI）的稳定性。
检测结果显示，冻融循环过程导致IB4+颗粒的显著减少，这与先前TRPS实验结果一致。更为重要的是，作者观察到双阳性GFP-mCherry的颗粒从基线增至IB4+颗粒的10%以上。
颗粒的亚群在冻融过程中液发生了不同的变化。sEV亚群中IB4+的颗粒数在前两个循环后显著减少，而双阳性颗粒轻微增加。lEV亚群中IB4+颗粒数量随循环次数波动，且双阳性事件从第一个循环起显著增加。
进一步分析lEV在总EV中的占比发现，所有EVs群体中lEV比例均随冻融循环显著增加。值得注意的是，双阳性EV中lEV占比最高，第四次循环后达87.35%（±3.75%）。
越来越多针对外泌体的研究，尤其是外泌体药物申报的增多，对外泌体的质量，特别是保存过程中质量的维持提出了更高的要求。虽然国际细胞外囊泡学会（ISEV）曾针对EV的存储策略提出建议，但最新指南仅要求明确记录EV或生物样本的存储方案。在近期ISEV专家共识文件中，关于存储对EVs物理特性与功能影响尚未达成统一意见。过去仅有少数研究关注此问题，且多集中于短期保存的影响分析，针对长期保存，例如数月到数年的研究主要评估存储生物样本中EVs的回收率。
本研究通过对EV的保存温度、保存液、不同保存策略等因素长达6个月的系统性研究，发现在不同条件下保存时长对EV回收率、尺寸大小、杂质蛋白浓度、Zeta电位等方面的影响，为后续EV保存条件的优化提供了可借鉴的策略。
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